张海云1,2，马佳宁3，李阳阳1,2，阳鹏辉1,2，宋伟艳1,2，刘松1*

　　摘要：酸性果胶裂解酶能以β-反式消去作用断裂果胶中的α-1,4糖苷键形成不饱和寡聚半乳糖醛酸，对食品等工业中高酯化果胶降解具有重要意义。该研究将黑曲霉Aspergillus nigerAG11来源的酸性果胶裂解酶（pelA）在大肠杆菌Escherichia coli, BL21(DE3)中进行表达，并进行了蛋白标签优化和酶学性质研究。最终确定在N-端融合碳水化合物结合结构域（carbohydrate-binding structural domain, CBM）时，pelA的胞内酶活力最高，达到3.25 U/mL，比初始条件下提高4.12倍。对CBM切除前后pelA的酶学性质进行测定。结果表明pelA的比酶活力、最适反应温度及最适反应pH分别为15.45 U/mg、40 ℃和5.0。pelA在30~50 ℃孵育2 h保持80%以上活性，这与pelA+CBM相同。在40 ℃、TG体育pH为4.0~5.0时孵育2 h，相对酶活力保持在60%以上，此时pelA+CBM具有80%以上的活性。以柑橘果胶为底物，pelA的Km和kcat分别为4.44 mmol/L和31.44s-1。该研究结果为pelA的分子改造和在工业生产中的应用奠定了基础。

　　为促进pelA在E. coli中的可溶性表达，分别在N-端融合木聚糖酶碳水化合物结合模块（CBM）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、TG体育大肠杆菌硫氧还原蛋白（TrxA）、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）等蛋白标签。其中，融合酶CBM-pelA表达后可溶性明显提高，胞内pelA活性达到3.25 U/mL，较野生型pelA酶活力提高4.12倍。

　　a-重组蛋白标签优化菌株表达载体构建；b-重组蛋白标签优化菌株军裂解液上清液酶活力

　　本研究在i中实现了A.nigerAG11来源的pelA蛋白的可溶性表达TG体育，并通过N-端融合蛋白标签的方式提高其溶解度，构建pelA的分子改造平台。该研究结果为pelA的分子改造和在工业生产中的应用奠定了基础。

　　刘松，江南大学未来食品科学中心研究员，硕士生导师。从事工业酶分子改造和食品级微生物（链霉菌TG体育、曲霉等）表达系统的开发。近年来在Biotechnology Advances、ACS Synthetic Biology、Journal of Agricultural and Food Chemistry及Bioresource Technology等生物工程类SCI期刊上发表研究论文40余篇，出版英文专著1部（副主编）；授权发明专利40余项，其中国际专利4项；主持国家自然科学基金（面上项目2项、TG体育青年基金项目1项）、江苏省自然科学基金、国家重点研发计划子课题、863子课题等纵向科研项目及10余项横向课题；获得中国轻工业联合会科学技术进步奖一等奖（2018，3/9），中国商业联合会科学技术奖一等奖（2017，4/6）和特等奖（2022，6/13）。2022年8月，任中国食品科学技术学会酶制剂分会理事。